1. 동물 모델 및 통증 유발
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동물 모델: Fos–FOS–2A–iCreERT2 (TRAP2), C57BL/6J, Oprm1Cre/Cre, Oprm1fl/fl 마우스를 활용하여 다양한 유전적 배경에서 실험을 수행했습니다.
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만성 신경병증성 통증 유발: 수정된 좌골신경 손상(SNI) 모델을 통해 만성 통증 상태를 유도하였으며, 이는 촉각 및 냉각 자극에 대한 과민 반응을 특징으로 합니다.
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TRAP 프로토콜: PainTRAP 및 Home-cageTRAP 유도 방식을 사용하여 특정 활성 신경 세포 집단을 표적화하고 유전적으로 조작하는 데 활용되었습니다.
2. 유전자 조작 및 바이러스 벡터
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MORp2 프로모터: 마우스 유전체 DNA에서 1.5kb MORp2 세그먼트를 선택 및 증폭하여 AAV 백본 기반의 플라스미드를 구축, 관심 유전자의 발현을 제어했습니다.
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바이러스 벡터: AAV9, AAVDJ, AAV5, AAV1 등 다양한 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 유전자 전달을 수행했으며, 이는 애드진(Addgene)에서 구매하거나 맞춤 제작되었습니다.
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정위 수술: 이소플루란 마취 하에 마우스의 ACC(전대상피질)에 AAV를 두개 내 주입하여 바이러스 확산 및 신경 세포 형질 도입을 유도했습니다.
3. 행동 분석 및 기계학습
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행동 테스트: 폰 프레이 필라멘트, 온수 및 아세톤 자극을 이용한 감각 반응 평가와 핫플레이트 테스트를 통해 통증 관련 행동 및 약물(모르핀, DCZ) 반응을 정량화했습니다.
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LUPE 시스템: Basler 카메라로 행동 비디오를 기록하고, DeepLabCut(DLC)을 활용하여 마우스의 20개 신체 부위 포즈를 정밀하게 추정했습니다.
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행동 분류 및 AMPS: A-SOiD/B-SOiD 기반의 랜덤 포레스트 분류기를 훈련시켜 정지, 걷기, 몸단장, 뒷발 핥기 등 6가지 행동을 분류했습니다. 또한, 행동 상태 분포에 대한 주성분 분석(PCA)을 통해 AMPS(Automated Mouse Pain Scale)를 개발하여 통증 강도를 단일 지표로 정량화했습니다.
4. 신경 활동 측정 및 분자 분석
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생체 내 칼슘 이미징: 미니스코프(miniscope)를 사용하여 마우스 ACC의 신경 활동을 실시간으로 기록, 급성 캡사이신 및 만성 신경병증성 통증 조건에서의 신경 반응을 분석했습니다.
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조직학 및 분자 분석: 면역조직화학(IHC) 및 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 특정 단백질 및 mRNA(Oprm1, Fos 등) 발현을 시각화하고 정량화했습니다.
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단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-seq): 기저외측 편도체(basolateral amygdala)에서 단일 핵 RNA 시퀀싱을 수행하여 유전자 발현 프로파일을 분석하고, 클러스터링 및 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석을 통해 기능적 특성을 규명했습니다.
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정량 PCR (qPCR): 특정 유전자의 mRNA 전사체 수준을 qPCR로 측정하여 유전자 발현 변화를 검증했습니다.
5. 폐쇄 루프 광유전학
- 실시간 장소 선호도: AAV1–MORp–DIO–iC++ 주입 및 광섬유 임플란트가 적용된 마우스를 대상으로 폐쇄 루프 광유전학 시스템을 활용, 비선호 공간에서의 LED 자극이 통증 완화 및 장소 선호도 변화에 미치는 영향을 평가했습니다.